Die Dynamik von Immunzellen wird einzeln entfaltet

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 2285 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die normotherme maschinelle Perfusion (NMP) hat sich als innovative Technik zur Organerhaltung herausgestellt. Es ist wichtig, ein Verständnis für die Zusammensetzung der Immunzellen des Spenderorgans und ihre dynamischen Veränderungen während der NMP zu entwickeln. Unser Ziel war eine umfassende Charakterisierung der (Sub-)Populationen von Immunzellen, des Zellhandels und der Zytokinfreisetzung während der Leber-NMP. Das Einzelzell-Transkriptomprofil menschlicher Spenderleber vor, während der NMP und nach der Transplantation zeigt eine Häufigkeit von Neutrophilen des CXC-Chemokinrezeptors 1+/2+ (CXCR1+/CXCR2+), die während der NMP deutlich abnahm. Parallel dazu kommt es zu einem starken Ausfluss von Passagierleukozyten mit überwiegend neutrophilen Zellen im Perfusat. Während der NMP wechseln die Neutrophilen von einem entzündungsfördernden Zustand zu einem gealterten/chronisch aktivierten/erschöpften Phänotyp, während entzündungshemmende/tolerogene Monozyten/Makrophagen erhöht sind. Wir beschreiben hier die Dynamik des Immunzellrepertoires, phänotypische Immunzellverschiebungen und eine Dominanz von Neutrophilen während der Leber-NMP, die möglicherweise zur Entzündungsreaktion beitragen. Unsere Ergebnisse können als Ressource für die Initiierung zukünftiger immuninterventioneller Studien dienen.

Die Lebertransplantation (LT) ist die einzige endgültige Behandlung einer Lebererkrankung im Endstadium1,2,3. Der Organmangel bleibt ein wesentlicher limitierender Faktor, da die Nachfrage das Angebot bei weitem übersteigt. Der Bedarf an besseren Konservierungstechnologien in Verbindung mit höheren Nutzungsraten bei Organen von Spendern mit erweiterten Kriterien (ECD) führte zur Entwicklung der normothermen maschinellen Perfusion (NMP). Dabei wird ein Organ kontinuierlich unter nahezu physiologischen Bedingungen bei 37 °C mit sauerstoffhaltigen, heparinisierten Erythrozytenkonzentraten, ergänzt mit Nährstoffen und Antibiotika, und in einem geschlossenen sterilen System durchströmt. NMP ermöglicht eine umfassende Bewertung der Organqualität und -funktion während der Ex-vivo-Konservierung und kann als Plattform für die Rekonditionierung, Behandlung und Reparatur extrakorporaler Organe dienen2,4,5,6,7,8,9.

Viele Hundert Organe wurden erfolgreich maschinell perfundiert, und die kurzfristigen Ergebnisse deuten darauf hin, dass NMP dazu beitragen könnte, die Organauswurfrate zu senken und eine ordnungsgemäße Auswahl von für die Transplantation geeigneten Organen zu ermöglichen4,10,11,12. Während die grobe Organfunktion leicht messbar ist, ist über den Immunstatus eines Organs und seiner geweberesidenten Leukozyten während NMP nur wenig bekannt. In experimentellen Studien zur Ex-vivo-Perfusion von Lunge und Niere wird eine große Anzahl von Passagierleukozyten mobilisiert und extravasiert in das Perfusat, wodurch die Immunogenität des Transplantats beeinträchtigt wird13,14. Es wurden auch Daten veröffentlicht, die auf eine Mobilisierung von Passagierleukozyten im Perfusat hinweisen, und zwar in Leber-NMP15. Angesichts der Entzündungsfähigkeit und der Größe lebereigener Immunzellen ist ein tieferes Verständnis des Einflusses von NMP auf den Status der hepatischen Immunzellen und ihrer Dynamik während NMP von entscheidender Bedeutung. Hierin wurde davon ausgegangen, dass die detaillierte Kartierung von Passagierleukozyten mithilfe der Technologie zur Einzelzell-RNA-Sequenzierung des gesamten Transkriptoms (scRNASeq)16 unser Verständnis der molekularen Mechanismen, einschließlich entzündlicher Schaltkreise während der Leber-NMP, erheblich verbessern würde. In den letzten Jahren zielten scRNASeq-Studien darauf ab, die zelluläre Heterogenität menschlicher Lebern unter verschiedenen Bedingungen zu bewerten, einschließlich Ischämie/Reperfusionsverletzung (IRI)17,18,19,20,21,22,23,24. Eine detaillierte serielle Immunzellkartierung von acht menschlichen Spenderlebern vor und nach der NMP wurde durchgeführt, um gezielt die Quelle immunmodulatorischer Zytokine/Chemokine und die Dynamik der Immunaktivierung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Wir validierten und visualisierten unsere Ergebnisse durch Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung (IF) in Leberbiopsien. Die entsprechende Mobilisierung von Immunzellen wurde durch Phänotypisierung in seriellen Perfusatproben, die während 26 NMPs der menschlichen Leber gesammelt wurden, sowie durch Zytokinprofilierung und -quantifizierung charakterisiert.

In dieser Arbeit zeigt die Tiefenkartierung von Immunzellen die Dominanz von Neutrophilen in menschlichen Spenderlebern, die früh während der Leber-NMP in das Perfusat mobilisiert werden. Die Beurteilung des Phänotyps und der Dynamik des hepatischen Immunzellrepertoires zusammen mit den entsprechenden Zell-Zell-Kommunikationsmustern erweitert unser Verständnis der Immunologie normothermisch maschinenperfundierter Lebern.

Eine Übersicht über die gesamte Studienpopulation ist in Tabelle 1 dargestellt (einzelne Daten sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt). Detaillierte Informationen zu Studienlebern und Analysen sind als Arbeitsablaufschema in Abb. 1 dargestellt. Die Entscheidung zur Anwendung von NMP basierte auf einer oder einer Kombination der folgenden Indikationen: (D) vermutete geringe Organqualität, (R) chirurgisch komplexer Empfänger und /oder (L) Logistik (Quelldatendatei). Die NMP-Zeit hing von der für die Beurteilung erforderlichen Zeit und der angestrebten Zeit für die Operation ab2,4,25. Die mittlere NMP-Zeit betrug 19,13 Stunden (Interquartilbereich (IQR) 11,56–21,64). Der mittlere Spitzenwert der Aspartat-Transaminase (AST) und Alanin-Transaminase (ALT) betrug 6410 U/l (IQR 2422–13.696) und 3194 U/l (IQR 1402–7791), der mittlere Laktatspiegel nach 6 Stunden betrug 12 mmol/l ( IQR 18–180). Die Entscheidung, eine Leber zu transplantieren oder zu verwerfen, basierte auf den zuvor definierten Perfusatparametern2,4,25. Nach vordefinierten Kriterien (siehe Methoden) wurden 24 Lebern nach NMP transplantiert, zehn wurden jedoch abgelehnt, da die physiologischen pH-Werte nicht aufrechterhalten werden konnten, der Laktatabbau unzureichend war und die AST/ALT-Perfusatwerte hoch waren.

Während insgesamt 34 Spenderlebern in diese Studie einbezogen und NMP unterzogen wurden, wurden acht von 34 Spenderlebern zufällig für scRNASeq und 26 von 34 für die Perfusatprobenahme ausgewählt. Darüber hinaus wurden in allen 34 Lebern Gewebeproben entnommen, um die Ergebnisse auf Proteinebene zu bewerten und zu validieren. Es werden Informationen zu den Zeitpunkten der Entnahme, Analyse, Spender- sowie Transplantationsstatus der Organe bereitgestellt. FFPE, frisch gefroren, in Paraffin eingebettet, normotherme NMP-Maschinenperfusion, RP-Reperfusion, IF-Immunfluoreszenz, IHC-Immunhistochemie, DBD-Spender nach Hirntod, DCD-Spender nach Kreislauftod.

Der mittlere Empfängermodell-Score für Lebererkrankung im Endstadium (MELD) und Risikobalance (BAR) betrug 14 (IQR 11–18) und 7 (IQR 7–10). Das mittlere Empfängeralter betrug 60 Jahre (IQR 55–68). Der mittlere Aufenthalt auf der Intensivstation (ICU) und der gesamte Krankenhausaufenthalt betrugen 5 (IQR 3–9) bzw. 21 Tage (IQR 15–30). Neun Patienten (37 %) entwickelten eine frühe Allotransplantat-Dysfunktion (EAD). Komplikationen vom Clavien-Dindo-Grad >3 traten bei 11 (46 %) Patienten auf. Drei Patienten starben an einer Pilzsepsis, einer an einer Clostridium-difficile-Sepsis und einer an einer Cholangiosepsie. Das durch den Tod zensierte Transplantatüberleben betrug 100 % (Tabelle 2).

Als erster Schritt wurde das gesamte Immunzellrepertoire von acht Spenderlebern, die NMP unterzogen wurden, vor NMP (T0), am Ende von NMP (T1) und nach Reperfusion (T2) mithilfe von scRNASeq-Profiling charakterisiert (Abb. 2A). Wir haben die relevantesten Zellpopulationen mithilfe unbeaufsichtigter Clusterbildung annotiert (Abb. 2B). Unsere Analysen beschreiben die zelluläre Zusammensetzung und Genexpressionsdynamik aller Leberzelltypen, aus denen das Parenchym besteht, einschließlich Leberentzündungszellen. Während der gesamte Datensatz zur Verfügung gestellt wird und der Genexpressionsphänotyp und die Dynamik der einzelnen Zellen interessant und relevant sind, lag der Schwerpunkt dieser Studie auf den dynamischen Veränderungen hepatischer Entzündungszellen während der Ex-vivo-Perfusion menschlicher Spenderleber.

Ein Überblick über den scRNASeq-Workflow. Die Anteile von Epithelzellen (KRT18), Leukozyten (PTPRC/CD45) und Endothelzellen (SPARC) im erhaltenen scRNASeq-Datensatz sind angegeben. B UMAP-Diagramm (Uniform Manifold Approximation and Projection) von 118.448 einzelnen Zellen, farblich nach Zelltyp codiert. C Relative Zelltypzusammensetzung im Lebergewebe von acht einzelnen Patienten. D UMAP-Diagramme, farbcodiert für die Expression der angegebenen zelltypspezifischen Markergene (rote Pfeilspitzen). E Genexpressionsniveaus zelltypspezifischer Marker. F Der Anteil der Leukozytenpopulationen im Lebergewebe, bestimmt durch scRNASeq vs. Durchflusszytometrie. G UMAP-Diagramm, gefärbt nach der Anzahl der Transkripte pro Zelle. Die Farbskala ist auf 20.000 begrenzt. H-Boxplot der Transkriptzahl pro Zelltyp. Die Werte geben den Durchschnitt pro Patient an (n = 8). Die Mittellinie bezeichnet den Median. Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) der Daten dar, Whisker erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten innerhalb des 1,5-fachen IQR.

Markergene wurden analysiert, um bestimmte Zelltypen zu annotieren, wie Neutrophile (FCGR3B), Monozyten/Makrophagen (CD68), CD3+ T-Zellen (CD3E), CD4+ T-Zellen (CD4), CD8+ T-Zellen (CD8A), regulatorische T-Zellen (Tregs). ) (FOXP3), natürliche Killerzellen (NK) (NKG7), dendritische Zellen (FLT3), Vorläuferzellen (CD24), B-Zellen (CD79A), Plasmazellen (JCHAIN), Hepatozyten (ALB), Endothelzellen (FLT1) und Cholangiozyten (KRT19; Abb. 2D, E, ergänzende Abb. 2). Um eine robuste Dateninterpretation sicherzustellen, haben wir uns auf Markergensignaturen konzentriert, um unterschiedliche Zelltypen zu definieren, was die Gültigkeit unseres Annotationsprozesses (Quelldatendatei) bestätigte.

Während eine gewisse Heterogenität zwischen den Patienten beobachtet wurde, war die gesamte Zellzusammensetzung zwischen den Organen vergleichbar (Abb. 2C, ergänzende Abb. 3A, B). Neutrophile wurden bei allen Patienten als wichtigster Immunzellcluster identifiziert (48,7 %; 57.564 Zellen) und die Monozyten/Makrophagen-Linie als zweitdominantester Immunzelltyp insgesamt in der Leber (7,75 %; 18.682 Zellen; Abb. 2C; individuell). Patienten siehe Quelldatendatei). Übereinstimmend zeigte die Immunhistochemie (IHC), dass Neutrophile (CD15) und Monozyten/Makrophagen (CD68) dominante residente Leukozytenpopulationen im Lebergewebe sind (ergänzende Abbildung 4). Der Anteil der durch scRNASeq identifizierten Leukozyten wurde durch Durchflusszytometrie in den entsprechenden Proben validiert (Abb. 2F).

Neutrophile zeichneten sich durch einen außergewöhnlich niedrigen mRNA-Gehalt und damit durch eine relativ geringe Anzahl detektierter Transkripte pro Zelle aus (Abb. 2G, H; zusätzliche QC-Metriken sind in der ergänzenden Abb. 3D, E dargestellt). Wir haben kürzlich gezeigt, dass der BD Rhapsody-Workflow im Vergleich zu anderen scRNASeq-Plattformen eine besonders hohe Anzahl an mRNA-Molekülen pro Zelle erfasst und sich daher möglicherweise besonders gut für die Darstellung von Zellen mit niedrigem mRNA-Gehalt eignet26. Aufgrund der relativ hohen Anzahl an mRNA-Molekülen, die pro Zelle eingefangen werden, wurden in unserem scRNASeq-Datensatz Neutrophile mit einem relativ geringen mRNA-Gehalt identifiziert (Abb. 2H; mittlere nCount_RNA: 4106; mittlere nCount_RNA in Neutrophilen: 2050), jedoch nicht in zuvor veröffentlichten Datensätze.

Zusammenfassend basiert der Immunzellatlas auf insgesamt 21 Biopsien, die von acht menschlichen Spenderlebern vor, am Ende der NMP sowie nach der Reperfusion entnommen wurden. Unsere Analysen entfalten die zelluläre Zusammensetzung und zeigen bisher unerkannte Neutrophile in Einzelzellauflösung.

Um den Einfluss von NMP auf die Immunzelllandschaft der Leber zu untersuchen, untersuchten wir Unterschiede in den scRNASeq-Profilen von seriellen Biopsieproben, die vor NMP (T0) und am Ende von NMP (T1) entnommen wurden (Abb. 3A; Zellzahlen jeder Zelle). Typ bei T0 und T1 werden in der Quelldatendatei angezeigt).

Ein UMAP-Diagramm von 90.404 einzelnen Zellen (nur T0- und T1-Proben), farblich nach Zelltyp codiert. B Relative Zelltypzusammensetzung im Lebergewebe vor (T0) und am Ende (T1) NMP. C UMAP-Diagramm von 90.404 Einzelzellen, farbcodiert nach Zeitpunkt [vor (T0) und am Ende (T1) NMP]. Die Cluster von Monozyten/Makrophagen (1) und Neutrophilen (2) sind hervorgehoben. D Multiplex-Immunfluoreszenzbilder von Immunologiemarkern, einzeln und zusammen mit Pan-Cytokeratin und der Phänotypisierungskarte vor (T0) und am Ende (T1) NMP. Die Phänotypisierungskarte wurde in InForm erstellt. Jeder Farbpunkt stellt einen Phänotyp der Zelle dar, schwarze Punkte: andere Zellen mit unbekanntem Phänotyp. Bilder werden mit 20-facher Vergrößerung angezeigt (Maßstabsleiste: 100 µm). E, F Zelldichten (Anzahl der Zellen/mm2) für einzelne immunologische Marker bei 10 Patienten. Das obere Feld E zeigt die Werte für jede einzelne Leber vor (T0) und am Ende (T1) NMP. Das untere Feld F präsentiert eine statistische Spaltenanalyse für jeden Biomarker (n = 10, gepaarter t-Test, zweiseitig, Mittelwert ± SEM, **p = 0,0097).

Am auffälligsten ist, dass der Anteil der Neutrophilen mit der Perfusionszeit abnahm, während sich der Anteil der Monozyten/Makrophagen, T-Zellen und B-Zellen während der NMP nur geringfügig veränderte (Abb. 3B). Die Verwendung einer Multiplex-IF-Färbung verschiedener Immunzellen in Biopsien aus 10 weiteren Lebern bestätigte diese Ergebnisse: NMP hatte keinen merklichen Einfluss auf die Anzahl und Verteilung von Monozyten/Makrophagen (CD68), T-Zellen (CD3 und CD8) und B-Zellen (CD20). , während die absolute Anzahl der Neutrophilen (CD15) im Laufe der Zeit signifikant abnahm (p < 0,001) (Abb. 3D–F), obwohl die Neutrophilen während der gesamten Perfusionsperiode prominent blieben (Abb. 3B, D–F).

Interessanterweise induzierte NMP eine bemerkenswerte Verschiebung im transkriptomischen Profil von Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen (Abb. 3C), während das zelluläre Stressniveau durch die relative Menge der nachgewiesenen mitochondrialen Transkripte (% MT, ergänzende Abb. 5A) und die Genexpression definiert wurde Die Spiegel einer Reihe wichtiger stress- und apoptosebezogener Transkripte (ergänzende Abbildung 5B) wurden durch NMP nicht merklich beeinflusst. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass NMP die Menge und das Verhältnis hepatischer Neutrophiler über die Perfusionszeit hinweg deutlich verringert, während andere wichtige Immunzelltypen nicht merklich beeinträchtigt werden.

Anschließend bewerteten wir die transkriptomische Signatur der Neutrophilen, die die größte intrahepatische Immunzellpopulation ausmachen, und kommentierten Subpopulationen, um den Einfluss von NMP auf Genexpression und Phänotypveränderungen detaillierter zu untersuchen. Abbildung 4A zeigt bekannte Markergene in Neutrophilen, einschließlich IFITM2, CSF3R, FPR1, FCGR3B, VNN2, G0S2, CXCR2 und SOD2. CXCR2 ist von besonderem Interesse, da es überwiegend im Neutrophilencluster exprimiert wird (Abb. 4B, C; individuelle Patienten- und Biopsiedaten sind in der ergänzenden Abb. 6A dargestellt). Wir beobachteten ein vergleichbares Expressionsmuster für CXCR1 (Abb. 4C, ergänzende Abb. 6B). Daher führte NMP zu einer signifikanten Verringerung der CXCR2- und CXCR1-Genexpressionsniveaus (Abb. 4D). Wir validierten die Expression des entsprechenden CXC-Chemokinrezeptor (CXCR)2-Proteins auf Neutrophilen durch Multiplex-IF-Färbung von 10 Lebern vor und am Ende von NMP (Abb. 4E). Ähnlich wie die abnehmende Neutrophilenzahl (Abb. 3D – F) war die CXCR2-Proteinexpression auf Neutrophilen während der NMP signifikant reduziert (Abb. 4F). Parallel dazu war die CXCR4-mRNA-Expression während der NMP deutlich erhöht, was auf einen möglichen Anstieg des Anteils erschöpfter/gealterter Neutrophiler hinweist (Abb. 4D)27.

A Genexpressionsniveaus von Neutrophilen-spezifischen Genen in einzelnen Zelltypen. B CXCR2-Genexpressionsniveaus in einzelnen Zelltypen. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert eines Patienten (n = 8). C UMAP-Diagramme von 41.177 Neutrophilen, farbcodiert nach Zeitpunkt und den Expressionsniveaus der Gene CXCR2, CXCR1 und CXCR4. D CXCR2-, CXCR1- und CXCR4-Genexpressionsniveaus in Neutrophilen vor (T0) und am Ende (T1) NMP. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert eines Patienten (n = 7). False-Discovery-Raten (FDR) wurden mithilfe einer Pseudo-Bulk-Analyse mit DESeq2 ermittelt. E Immunfluoreszenzfärbung von CXCR2 und CD15 vor (T0) NMP. Die Bilder werden mit 20-facher Vergrößerung angezeigt (Maßstabsleiste: 100 µm, n = 10, für jede Probe wurden 4 repräsentative Bilder aufgenommen). F Zelldichte (Anzahl der Zellen/mm2) von CXCR2+-Zellen vor (T0) und am Ende (T1) NMP. Das obere Diagramm stellt die Werte für jede einzelne Leber dar, das untere Diagramm ist eine statistische Spaltenanalyse (n = 10, gepaarter t-Test, zweiseitig, Mittelwert ± SEM, *p = 0,02). G CXCL8-Genexpressionsniveau in Neutrophilen vor (T0) und am Ende (T1) NMP. Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert eines Patienten (n = 7). False-Discovery-Raten (FDR) wurden mithilfe einer Pseudo-Bulk-Analyse mit DESeq2 ermittelt. H UMAP-Plot von 90.404 Einzelzellen (nur T0- und T1-Proben), gefärbt durch CXCL8-Genexpression. Die Cluster aus Monozyten/Makrophagen (1) und Neutrophilen (2) sind hervorgehoben. I Differenzielle Signalübertragung von Neutrophilen zu anderen Zelltypen. Oberes Feld: Differenziell exprimierte Liganden von Neutrophilen in T0 vs. T1 (zweiseitiger DESeq2-Wald-Test auf Pseudo-Bulk, p-Werte wurden an die False-Discovery-Rate (FDR) angepasst). Rote Farben zeigen eine Hochregulierung in T1 im Vergleich zu T0 an. Unteres Feld: Jeweilige Rezeptoren und die Expression nach Zelltyp. Punktgrößen und -farben beziehen sich auf den Anteil der Zellen, die den Rezeptor bzw. die Genexpression exprimieren, gemittelt über alle Patienten. Punkte werden nur für Rezeptoren angezeigt, die in mindestens 10 % der jeweiligen Zelltypen exprimiert werden. In allen Boxplots bezeichnet die Mittellinie den Median. Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) der Daten dar, Whisker erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten innerhalb des 1,5-fachen IQR.

Der Einfluss von NMP auf die Gensignatur von Neutrophilen wurde durch eine Analyse des differentiell exprimierten Gens (DEG) weiter bewertet (T0 vs. T1; am höchsten regulierte und ausgewählte DEG sind in der ergänzenden Abbildung 6C dargestellt). Wir haben während der NMP eine signifikante Hochregulierung von CXCL8/IL-8 im Neutrophilencluster festgestellt (Abb. 4G; Quelldatendatei). CXCL8 ist ein verwandter proinflammatorischer Ligand für CXCR2 und CXCR1 und vermittelt die Aktivierung von Neutrophilen und die Bildung von extrazellulären Neutrophilenfallen (NET)28. Neutrophile und in geringerem Maße Monozyten/Makrophagen waren die Hauptquellen für die CXCL8-Produktion (Abb. 4H). Dementsprechend zeigte die Analyse von Zell-zu-Zell-Kommunikationsnetzwerken mit CellChat29 eine autokrine Neutrophilenaktivierung (Abb. 4I) sowie eine durch Monozyten/Makrophagen ausgelöste Neutrophilenaktivierung (siehe unten) über CXCL8-CXCR1/CXCR2-Signalisierung während NMP.

Das Transkriptionsprofil von Neutrophilen am Ende von NMP ähnelte einem Phänotyp, den wir kürzlich als gealterte/chronisch aktivierte/erschöpfte Neutrophile in nicht-kleinzelligen Lungenkrebstumorgeweben identifiziert und charakterisiert haben (Abb. 5A: reduzierte Expression von CXCR1, CXCR2, PTGS2, SELL und erhöhte Expression von CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1)26. Die Hochregulierung von VEGFA (Abb. 5A, ergänzende Abb. 6C) sowie erhöhte VEGFA-KDR1/FLT1-Zellkommunikationsmuster von Neutrophilen zu Endothelzellen (Abb. 4I) legen nahe, dass während der NMP-Gewebereparatur durch Revaskularisierung von induziert wird beschädigtes Gewebe.

A Expression ausgewählter Markergene in Neutrophilen vor (T0) und am Ende (T1) NMP bei einzelnen Patienten (n = 7). Die Mittellinie bezeichnet den Median. Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) der Daten dar, Whisker erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten innerhalb des 1,5-fachen IQR. Zweiseitiger DESeq2-Wald-Test für Pseudo-Bulk, p-Werte werden mithilfe der unabhängigen Hypothesengewichtung (IHW) an die Falscherkennungsrate (FDR) angepasst. B UMAP von Neutrophilen, gefärbt durch Subcluster (N0, N1, N2, N3). C Expression ausgewählter Markergene in Neutrophilen-Subclustern. D Relative Zusammensetzung der Neutrophilen-Subcluster vor (T0) und am Ende (T1) NMP. E Differenzielle Aktivität des Transkriptionsfaktors (TF) pro Zelltyp in T0 vs. T1, berechnet mit DoRothEA. Rot zeigt die Hochregulierung eines TF-Regulons in T1 im Vergleich zu T0 an. Die p-Werte wurden mithilfe eines zweiseitigen t-Tests ermittelt und an die False-Discovery-Rate (FDR) angepasst. Die t-Statistiken wurden unter Verwendung eines multivariaten linearen Modells berechnet, wie es in De Coupler-Py implementiert ist. F Genset-Überrepräsentationsanalyse (ORA) ausgewählter „Hallmark“-Gensets pro Zelltyp in T0 vs. T1. Ein kleiner p-Wert zeigt an, dass unter den Genen im Gensatz mehr Gene unterschiedlich exprimiert werden, als zufällig erwartet wird (einseitiger exakter Fisher-Test).

Als nächstes trennten wir Neutrophile durch unbeaufsichtigtes Leiden-Clustering in vier Untergruppen (N0–N3; Abb. 5B; am höchsten regulierte Gene sind in der Quelldatendatei aufgeführt), was von allen Patienten unterstützt wurde (Supplementary Data 6D). Der N0-Cluster war durch die Expression entzündungsfördernder Gene gekennzeichnet, die die Migration von Neutrophilen zu Entzündungsherden induzieren (S100A12, S100A8, S100A9, MMP8, MMP9)30,31,32, den NETose-Cofaktor PADI433 sowie daran beteiligte Gene Integrin-vermittelte Zelladhäsion (ITGAM, ITGA1, ITGA6). Daher stellt der N0-Cluster einen entzündungsfördernden, hochaktivierten Neutrophilen-Phänotyp dar. Der N1-Cluster war dem N0-Cluster ziemlich ähnlich, zeigte jedoch eine erhöhte Expression von ITGA4 sowie von TAFA4, das die Reparaturfunktionen des Makrophagengewebes moduliert (Abb. 5C, Quelldatendatei). Bemerkenswert ist, dass der Anteil der proinflammatorischen N0- und N1-Neutrophilen im Verlauf der NMP deutlich abnahm, wohingegen N2-Neutrophile deutlich angereichert waren (Abb. 5D). Der N2-Cluster ähnelte dem oben beschriebenen gealterten/chronisch aktivierten/erschöpften Phänotyp (CXCR4, CD83, CCRL2, CCL3, CCL4, ICAM1, VEGFA). N2-Neutrophile exprimierten auch OLR1 (Abb. 5C, Quelldatendatei), einen Marker, den wir kürzlich in chronisch aktivierten tumorassoziierten Neutrophilen identifiziert haben26. Dementsprechend ergab die Aktivitätsanalyse des Transkriptionsfaktors (TF), dass NMP eine signifikante Induktion von PPARG auslöste (Abb. 5E), einem direkten Transkriptionsregulator von OLR135. Der N3-Cluster zeigte eine hohe Expression mitochondrialer Gene (MT-CYB, MT-ND4, MT-ATP6), was auf den Beginn der zellulären Apoptose hinweist, sowie von Genen, die an der Akute-Phase-Reaktion (SAA1, SAA2) und der Interferonsignalisierung (IFIT1, IFIT2)36 (Abb. 5C, Quelldatendatei). Bemerkenswerterweise nahmen die N3-Neutrophilen während der NMP ab (Abb. 5D).

Zusammenfassend deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass NMP Neutrophile von einem aktivierten proinflammatorischen Zustand in einen gealterten/chronisch aktivierten/erschöpften Phänotyp in menschlichen Lebern verschiebt, was auf eine Abschwächung akuter Entzündungsprozesse hindeutet, die durch Neutrophile während NMP ausgelöst werden.

Um Zusammenhänge zwischen Expressionsprofilen verschiedener Zellpopulationen und ausgewählten Gensätzen zu beurteilen, die auf zelluläre Prozesse und Wege hinweisen, wurden Gensatz-Anreicherungsanalysen (GSEA) durchgeführt (Abb. 5F). Bei Neutrophilen wurden mehrere Signalwege erkannt, die an Entzündungsreaktionen, Apoptose und Tumorsuppressoraktivitäten beteiligt sind. Monozyten/Makrophagen signalisierten Wege, die an Komplementeffektorfunktionen beteiligt sind. Die Komplementaktivierung ist an chronischen Entzündungsprozessen beteiligt, unterstützt aber auch eine immunsuppressive Mikroumgebung und induziert Angiogenese sowie Gewebereparatur37. Diese Ergebnisse deuten auf eine Verlagerung hin zu Monozyten/Makrophagen mit entzündungshemmenden, gewebeheilenden und regenerierenden Eigenschaften hin.

Da Monozyten/Makrophagen eine wichtige regulatorische Funktion bei hepatischen Entzündungsreaktionen haben, haben wir ihren Phänotyp detaillierter untersucht. Monozyten/Makrophagen, die durch die Expression von CD68-Zelloberflächenmarkern gekennzeichnet sind, wurden während der NMP in ihrem transkriptomischen Profil signifikant verändert (Abb. 3C, 6A, ergänzende Abb. 7A; Abb. 6B: bekannte Markergene in Monozyten/Makrophagenzellen CST3, CTSB, MS4A7, MARCH1). , CD68, MAFB, CD163, VCAN und CSF1R)38,39. Die erhöhte Expression von CXCL8 in Monozyten/Makrophagen (Abb. 4H) und die signifikante Induktion der proinflammatorischen Chemokine CCL2 und CCL3 (ausgewählte Top-DEG in Monozyten/Makrophagenzellen vor und am Ende von NMP sind in der ergänzenden Abb. 7C dargestellt). deuten darauf hin, dass sich der Phänotyp von Monozyten/Makrophagen während NMP in Richtung eines entzündungsfördernden Zustands verschiebt. Die Analyse der Zell-2-Zell-Kommunikation zeigte eine stark erhöhte Signalübertragung von SPP1 (Osteopontin) an seine verwandten Rezeptoren (z. B. CD44), die auf einer Vielzahl von Immunzellen exprimiert werden (Abb. 6G). Osteopontin beeinflusst akute und chronische Entzündungen, da es die Migration, Polarisation und Aktivierung von Immunzellen reguliert40. Im Gegensatz zur proinflammatorischen Stimulation verringerte NMP die Expression von Schlüsselgenen, die den Entzündungszustand von Monocyes/Makrophagen charakterisieren (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA, CSTA, CD74) und erhöhte das Expressionsniveau von Markern, die mit einem tolerogenen Phänotyp assoziiert sind (CD163, MARCO, HMOX1, VSIG4, NSMAF, CTSB, VMO1; Abb. 6B und ergänzende Abb. 7C)17. Traditionell werden Makrophagen entweder als entzündlich oder immunregulatorisch eingestuft41. Die VSIG4-Genexpression vermittelt die Toleranz gegenüber T- und natürlichen Killer-T-Zellen (NKT) während einer immunvermittelten Leberschädigung42. In ähnlicher Weise führt der Abbau von HMOX1 (Hämoxygenase) bei Mäusen zu einer Leberentzündung43. MacParland et al. zeigten, dass die Expression von MARCO überwiegend in nicht entzündlichen menschlichen Makrophagen erhöht ist17.

Ein UMAP-Diagramm von 13.720 Monozyten/Makrophagen, farbcodiert nach Zeitpunkt [vor (T0) und am Ende (T1) NMP] und des relativen CD68-Genexpressionsniveaus. B Genexpressionsniveaus von Entzündungsmarkern (LYZ, FCN1, VCAN, HLA-DRA) und tolerogenen Markern (CD163, MARCO, HMOX1 und VSIG4) in Monozyten/Makrophagen vor (T0) und am Ende von NMP (T1). Jeder Punkt repräsentiert den Mittelwert eines Patienten (n = 7). False-Discovery-Raten (FDR) wurden mithilfe einer Pseudo-Bulk-Analyse mit DESeq2 ermittelt. Die Mittellinie bezeichnet den Median. Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) der Daten dar, Whisker erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten innerhalb des 1,5-fachen IQR. C Genexpressionsniveaus von Monozyten-/Makrophagen-spezifischen Genen. D UMAP von Monozyten/Makrophagen, gefärbt durch Subcluster (M0, M1, M2, M3). E Expression ausgewählter Markergene in Monozyten/Makrophagen-Subclustern. F Relative Zusammensetzung der Monozyten-/Makrophagen-Subcluster vor (T0) und am Ende (T1) NMP. G Differenzielle Signalübertragung von Monozyten/Makrophagen zu anderen Zelltypen. Oberes Feld: Differenziell exprimierte Liganden von Monozyten/Makrophagen in T0 vs. T1 (zweiseitiger DESeq2-Wald-Test auf Pseudo-Bulk, p-Werte wurden an die False-Discovery-Rate (FDR) angepasst). Rote Farben zeigen eine Hochregulierung in T1 im Vergleich zu T0 an. Unteres Feld: Jeweilige Rezeptoren und die Expression nach Zelltyp. Punktgrößen und -farben beziehen sich auf den Anteil der Zellen, die den Rezeptor bzw. die Genexpression exprimieren, gemittelt über alle Patienten. Punkte werden nur für Rezeptoren angezeigt, die in mindestens 10 % der jeweiligen Zelltypen exprimiert werden. Es werden nur hochregulierte Liganden angezeigt. Die Liste der herunterregulierten Interaktionen ist in der Quelldatendatei verfügbar.

Um die Plastizität von Monozyten/Makrophagen während der NMP weiter zu untersuchen, führten wir unbeaufsichtigtes Leiden-Clustering durch und identifizierten vier unterschiedliche Untergruppen (M0 bis M3) (Abb. 6D, Abb. 6E; am höchsten regulierte Markergene sind in der Quelldatendatei aufgeführt) in allen Lebern (Ergänzende Abbildung 7D). Der M0-Subcluster zeigte eine hohe Expression mehrerer proinflammatorischer Gene, was darauf hindeutet, dass dieser Cluster entzündliche Monozyten/Makrophagen darstellt (LYZ, VCAN, S100A8, S100A9, S100A12, MNDA). Im Einklang mit der DEG-Analyse war der Anteil proinflammatorischer M0-Monozyten/Makrophagen während der NMP stark reduziert (Abb. 6F). Der M1-Subcluster war einer häufig gemeldeten C1Q+-Makrophagenpopulation (C1QB, MRC1, HLA-DOA, FOLR2) auffallend ähnlich44. Die beobachtete Hochregulierung von Komplementweg-bezogenen Genen (C1QB, C1QC, AXL) lässt auf eine mögliche Rolle des M1-Subclusters bei der Beseitigung von verletztem Gewebe durch Efferozytose schließen45,46. Im Gegenteil, der M2-Cluster zeigte ein Genexpressionsprofil, das mit nicht-klassischen Monozyten (CDKN1C, CYFIP2)47,48 vergleichbar ist, sowie eine hohe Expression von CX3CR1, einem Marker, der Monozyten definiert, die sich konstitutiv in Geweben einfinden und zur Gewebereparatur beitragen Wundheilung49. Während sich die M1- und M2-Subcluster während der NMP nicht wesentlich veränderten, war der M3-Cluster deutlich erhöht (Abb. 6F). Dieser Subcluster war durch die Expression von Markern gekennzeichnet, die überwiegend mit alternativ aktivierten („M2-ähnlichen“) Makrophagen assoziiert sind. M2-ähnliche Makrophagen induzieren Zellproliferation und Angiogenese, sind aber auch an der Beseitigung von Zelltrümmern und der Förderung der Gewebereparatur beteiligt (PLAU, CXCL5, CFS1, FPR3, SPP1, CTSL, IL4I1, HS3ST1, SERPINB2, SLC7A11)50,51,52,53, 54,55,56,57,58,59,60,61. Der M3-Subcluster exprimierte auch FN1 (Fibronektin), das an der Bildung der extrazellulären Matrix und an Wundreparaturmechanismen beteiligt ist62. Bemerkenswert ist, dass die Zell-2-Zell-Kommunikationsanalyse in Monozyten/Makrophagen eine erhöhte FN1-Signalübertragung anzeigte, z. B. in Richtung seines verwandten Rezeptors ITGB1, der auf Cholangiozyten exprimiert wird (Abb. 6G). Darüber hinaus wurden im M3-Cluster zahlreiche entzündungshemmende Marker identifiziert: Die Marker PHLDA1, MMP19, FABP5, NRP1, NRP2, RASGRP3, DHRS9 und MT1H weisen auf eine mögliche Abschwächung der proinflammatorischen Zytokinproduktion hin63,64,65,66,67 ,68,69,70,71.

Zusammenfassend zeigten unsere Daten, dass die Induktion entzündungsfördernder Hersteller und eines insgesamt entzündungsfördernden Phänotyps von Monozyten/Makrophagen mit der Induktion entzündungshemmender und tolerogener („M2-ähnlicher“) Zellsubtypen einhergeht, die zur Zellproliferation beitragen. Angiogenese, Wundheilung und Gewebereparatur.

Nachdem wir die Einzelzelllandschaft geweberesidenter Immunzellen während der NMP definiert hatten, konzentrierten wir uns als nächstes auf das Perfusatkompartiment. Daher untersuchten wir die Immunzelldynamik im Perfusat von weiteren 26 Lebern und verknüpften diese Beobachtungen mit intrahepatischen Immunzellveränderungen während NMP (Abb. 7A). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde in einer Reihe von Perfusatproben bestätigt (Abb. 7B). Bereits 1 Stunde nach NMP-Initiierung wurde ein rascher Anstieg der absoluten CD45+-Leukozytenzahlen beobachtet (2537/µl [2003, 3215]). Die dominierenden Untergruppen waren CD45+HLA-DRlow-Granulozyten (1947/µl [1510, 2511]), CD45+CD3+ T-Zellen (203/µl [157, 263]), CD45+CD56+ NK-Zellen (99/µl [68, 143]). ]), CD45+CD19+ B-Zellen (52/µl [38, 71]) und CD45+CD14+ Monozyten/Makrophagen (37/µl [26, 54]) (Abb. 7C, D). Die Regressionsanalyse zeigte eine statistisch signifikante Veränderung der absoluten Zellzahlen über die Perfusionszeit für alle Leukozyten-Subtypen. Während CD45+CD19+-B-Zellen und CD45+CD14+-Monozyten/Makrophagen nach 6 Stunden ihren Höhepunkt erreichten, wurde für alle Untergruppen nach 6 Stunden NMP ein Rückgang der Gesamtleukozytenzahl beobachtet (Abb. 7E, F, Ergänzungstabelle 2).

Ein NMP-Perfusat-Analyse-Workflow und angewandte Methoden. B Zelllebensfähigkeitstests vor der Durchflusszytometrie (n = 3 vor, nach 1 Stunde NMP und am Ende der NMP) zeigten nur einen sehr geringen Prozentsatz nicht lebensfähiger Zellen im Perfusat. C Absolute CD45+-Leukozytenmengen für die Hauptsubtypen der Immunzellen im gesamten zirkulierenden Perfusat (Mittelwert ± SEM) und D-Zusammensetzung bei 1 h NMP. E, F Dynamische Veränderung der gesamten CD45+-Leukozyten und Hauptsubtypen während NMP. G Dynamische Veränderung der CD3+-T-Zell-Subtypen (Anteile) über die Perfusionszeit. Grafiken zeigen die marginalen Effekte. Die Werte werden mithilfe einer linearen Regressionsanalyse geschätzt. Die p-Werte beziehen sich auf die Veränderung über die Zeit. Die mithilfe eines linearen Modells berechneten Mittelwerte der kleinsten Quadrate werden zusammen mit dem 95 %-KI angezeigt. N = 26 biologisch unabhängige Proben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. NK-Zellen, natürliche Killerzellen, NKT-Zellen, natürliche Killer-T-Zellen, MAIT-Zellen, Schleimhaut-assoziierte invariante T-Zellen.

Der im scRNASeq-Immunzellatlas und in der IF-Färbung im Lebergewebe identifizierte Anteil an Neutrophilen nahm im Laufe der NMP-Zeit ab, während im Perfusat eine hohe absolute Anzahl an Neutrophilen gefunden wurde. Diese entsprechenden Befunde deuten auf eine schnelle Migration von Neutrophilen in das Perfusat hin. Dies gilt – wenn auch in geringerem Maße – auch für andere Entzündungszellen. Diese zellulären Verschiebungen entsprechen hinsichtlich ihrer grundlegenden quantitativen Muster und Dynamik den Mustern von Immunzellen, die in Leberbiopsien gewonnen wurden. Zusammenfassend wurde eine schnelle und signifikante Migration hauptsächlich von Neutrophilen in das Perfusat festgestellt.

Wir haben die Subtypen der wichtigsten Immunzellpopulationen und ihre dynamischen Veränderungen in fünf seriellen Perfusatproben mithilfe der Durchflusszytometrie weiter charakterisiert. Bei 1-stündiger NMP bestanden die CD45+CD3+-T-Zell-Untergruppen im Perfusat zu 48 % [42, 54] aus CD3+CD4+-T-Helferzellen, während 44 % [37, 50] zytotoxische CD3+CD8+-T-Zellen waren. Der Anteil beider Untergruppen veränderte sich im Laufe der Perfusionszeit signifikant zugunsten der CD4+ T-Helferzellen. CD3+CD56+-NKT-Zellen und CD3+-T-Zellrezeptor (TCR) Vα2.2+CD161+-Schleimhaut-assoziierte invariante T-Zellen (MAIT) stellten nur kleine Anteile der gesamten T-Zellen ohne relevante Dynamik über die Perfusionszeit dar (Abb. 7G). Die Anteile der CD3+CD4+-Gedächtnis-T-Zellen veränderten sich im Verlauf der Perfusionszeit signifikant (Abb. 8A), wohingegen CD3+CD8+-Gedächtnis-T-Zellen stabil blieben (Abb. 8B). CD4+CD25+FoxP3+ Tregs machten nach 1 Stunde 2,32 % [1,58, 3,28] der T-Zellpopulation aus. Bemerkenswert ist, dass ihr Anteil im Laufe der Perfusionszeit signifikant auf 4,71 % [3,29, 6,59] bei 24-Stunden-NMP anstieg (Abb. 8C). CD45+CD56+ NK-Zellen waren überwiegend CD56dimCD16+ (94,21 % [96,11, 91,58] ohne signifikante Veränderungen im Laufe der Zeit (Abb. 8D). Unter den CD14+CD16+ Monozyten/Makrophagen machten CD14+CD64+CD163+ Kupffer-Zellen nur geringe Anteile im Perfusat aus nach 1 Stunde (5,56 % [3,39, 8,78]), es wurde jedoch ein starker proportionaler Anstieg bei längerer Perfusion beobachtet (24-Stunden-NMP: 11,86 % [7,05, 19,52], Abb. 8E). Unter den zahlenmäßig prominenten Subtypen (d. h. CD45+HLA -DRniedrige Granulozyten), CD15+CD16+-Neutrophile dominierten (93,45 % % [88,90, 96,30]) gegenüber sehr wenigen Siglec-CD8+CD16-Eosinophilen (0,38 % [0,20, 0,59]) und CD16+CD123+-Basophilen (0,23 % [ 0,13, 0,34]) bei 1 h NMP. Ihre Anteile blieben über die Zeit unverändert (Abb. 8F). Dendritische Zellen stellten nur einen kleinen Anteil der gesamten Leukozyten dar (0,86 % [0,53, 1,27] bei 1 h NMP) ohne signifikante Dynamik während des NMP (Abb. 8G, Ergänzungstabelle 3).

Zu verschiedenen Zeitpunkten während der NMP gesammelte Perfusate (n = 26 NMP-behandelte Lebern) wurden auf ihre dynamischen Veränderungen der Anteile von A CD4+ T-Zellen, B CD8+ T-Zellen, C Subtypen von CD3+ T-Zellen mit regulatorischen Eigenschaften und D CD56+ NK untersucht Zellen, E CD45+CD14+-Monozyten/Makrophagen, F CD45+HLA-DRlow-Granulozyten und G dendritische Zellen. Grafiken zeigen die marginalen Effekte. Die Werte werden mithilfe einer linearen Regressionsanalyse geschätzt. Die p-Werte beziehen sich auf die Veränderung über die Zeit. Die mithilfe eines linearen Modells berechneten Kleinste-Quadrate-Mittelwerte werden zusammen mit dem 95 %-KI angezeigt. N = 26 biologisch unabhängige Proben. H Genexpressionsniveaus der angegebenen proinflammatorischen Faktoren (Interleukine/Chemokine) in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen vor (T0) und am Ende von NMP (T1), ermittelt durch scRNASeq in acht Spenderlebern. I Spektrum der bewerteten proinflammatorischen Interleukine/Chemokine, die von Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen produziert werden und auf Proteinebene in Perfusatproben erhöht sind, die über die Perfusionszeit von 26 Spenderlebern gesammelt wurden. (J) Genexpressionsniveaus von IL-6 und TNF in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen vor (T0) und am Ende von NMP (T1), bewertet durch scRNASeq in transplantierten (n = 6) und verworfenen (n = 2) Lebern . Die Mittellinie bezeichnet den Median. Kästchen stellen den Interquartilbereich (IQR) der Daten dar, Whisker erstrecken sich bis zu den extremsten Datenpunkten innerhalb des 1,5-fachen IQR. Darüber hinaus wurden die IL-6- und TNF-Spiegel im Perfusat von 26 Spenderlebern, die NMP ausgesetzt waren, nach 1, 4, 6, 12 und 24 Stunden NMP sowie Unterschiede zwischen transplantierten (n = 18) und verworfenen (n = 8) gemessen. Lebern wurden berechnet. Grafiken zeigen die marginalen Effekte. Die Werte werden mithilfe einer linearen Regressionsanalyse geschätzt. Die p-Werte beziehen sich auf die Veränderung über die Zeit. Die mithilfe eines linearen Modells berechneten Mittelwerte der kleinsten Quadrate werden zusammen mit dem 95 %-KI angezeigt. N = 26 biologisch unabhängige Proben. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Tcm: zentrale Gedächtnis-T-Zellen, Tem: Effektor-Gedächtnis-T-Zellen, Temra: CD45RA-T-Zellen reexprimierende Effektor-Gedächtniszellen, DN T-Zellen: doppelt negative T-Zellen (CD4− und CD8-), NK-Zellen, natürliche Killerzellen, DCs dendritische Zellen.

Diese Daten verdeutlichen die Mobilisierung eines breiten Leukozytenspektrums im zirkulierenden Perfusat während der NMP. Die Analyse von Reihenproben, die im Verlauf des 24-stündigen NMP-Zeitraums entnommen wurden, ergab eine ausgeprägte Migrationsdynamik. Während die Migration einer Reihe von Immunzell-Subtypen in das Perfusat sehr schnell erfolgte, nahm die Mobilisierung und Freisetzung von Tregs- und Kupffer-Zellen bereits 12 Stunden nach NMP zu.

Als nächstes untersuchten wir die Genexpressionsniveaus von Interleukin/Chemokin in Immunzellen und die Proteinniveaus in seriellen Perfusatproben. Während Monozyten/Makrophagen zunehmend proinflammatorisches IL1B, IL18, CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4 und TNF exprimierten, exprimierten Neutrophile hauptsächlich CXCL8 und – in geringerem Maße – IL1B und CXCL1 (Abb. 8H). Die Expression entzündungshemmender Marker wie IL10 wurde in Monozyten/Makrophagen induziert (Abb. 8H)72.

Im Einklang mit dem transkriptomischen Datensatz nahmen im Perfusat mit der Zeit auch die in Monozyten/Makrophagen und Neutrophilen exprimierten proinflammatorischen Zytokine zu, was auf eine erhöhte Transkription und Proteinfreisetzung in die hepatische Mikroumgebung und das Perfusat hinweist (Abb. 8I). Ergänzende Abbildung 8 zeigt die Dynamik aller Zytokine/Chemokine auf Proteinebene über die Perfusionszeit (die jeweiligen Werte sind in ergänzender Tabelle 4 angegeben). In den transkriptomischen Signaturen von T- und NK-Zellen wurden nur geringfügige Veränderungen festgestellt (ergänzende Abbildung 9).

Der Einfluss des Spendertyps (Spende nach Hirntod (DBD) vs. DCD) und der Eignung für eine Transplantation (transplantierte vs. verworfene Lebern) auf die Proteinzytokindynamik wurde detaillierter untersucht. Die meisten Perfusat-Zytokine waren in allen Gruppen mit längerer Perfusionszeit erhöht. Die IL-6-Konzentrationen waren im Perfusat von DCD-Transplantaten im Vergleich zu DBD-Transplantaten am signifikantesten erhöht (p = 0,05, ergänzende Abbildung 10, ergänzende Tabelle 5). Dieses Phänomen wurde auch beim Vergleich von weggeworfenen Lebern mit transplantierten Lebern beobachtet (p = 0,032, Abb. 8J, ergänzende Abb. 10, ergänzende Tabelle 6). Übereinstimmend fanden wir eine erhöhte IL6-Expression in Monozyten/Makrophagen auf Transkriptionsebene, was darauf hindeutet, dass dieser Zelltyp zumindest wesentlich zur IL-6-Produktion beiträgt (Abb. 8J). Zusätzlich zu IL-6 war auch der Tumornekrosefaktor (TNF) im Perfusat signifikant erhöht, wenn verworfene mit transplantierten Lebern verglichen wurden (p = 0,012, Abb. 8J, ergänzende Abb. 11, ergänzende Tabelle 6).

Zusammengenommen deuten unsere Daten darauf hin, dass die immunologische Reaktion während der Leber-NMP je nach Spendertyp und „niedriger Qualität“ (nicht für eine Transplantation geeignet) vs. „akzeptablen“ Transplantaten unterschiedlich ist.

Ex-vivo-NMP menschlicher Organe ist ein sich rasch weiterentwickelndes klinisches Instrument zur Verbesserung und Verlängerung der Organerhaltung. Darüber hinaus erfüllt die Möglichkeit, die Funktion vor der Transplantation zu beurteilen, einen ungedeckten Bedarf und bietet eine einzigartige Möglichkeit, die molekularen Ereignisse während der Reperfusion aufzuklären. Diese Technologie könnte auch den Weg für eine künftige gezielte Ex-vivo-Organbehandlung bereiten. Da die Leber eine große Menge an Immunzellen mit wichtigen immunregulatorischen Funktionen enthält und von zentraler Bedeutung für eine angemessene Leberfunktion ist73, haben wir Immunzell(sub)populationen in menschlichen Spenderlebern und Perfusat während der NMP eingehend charakterisiert und Perfusatzytokine bewertet. Eine detaillierte Kartierung von Immunzellen deutete auf ein Vorherrschen von Neutrophilen in der Leber des Spenders hin, die während der NMP umgehend in das Perfusat mobilisiert werden. Neutrophile gehen von einem aktivierten proinflammatorischen Zustand in einen gealterten/chronisch aktivierten/erschöpften Phänotyp über und Monozyten/Makrophagen zeigen entzündungshemmende/tolerogene Eigenschaften, die für die Gewebereparatur unerlässlich sind.

NMP in 34 menschlichen Spenderlebern, die in diese Studie einbezogen wurden, verlief ereignislos und ermöglichte eine wiederholte Beurteilung von Gewebe- und Perfusatproben ohne Auswirkungen auf die Organintegrität. Neutrophile wurden als die am häufigsten auf Immunzellpopulationen basierende sc-Transkriptomik identifiziert, die an acht Spenderlebern durchgeführt wurde. Die Multiplex-IF- und IHC-Analyse bestätigte, dass CD15+-Neutrophile der dominierende hepatische Immunzelltyp sind und in einem fleckigen Muster über das gesamte Organ verteilt sind. Interessanterweise wird die Abstammungslinie der Neutrophilen nach unserem besten Wissen in bisher veröffentlichten scRNASeq-Datensätzen menschlicher Lebern vollständig ausgeschlossen17,18,19,22,23,24,74. Diese Diskrepanz ist höchstwahrscheinlich eher auf methodische Fallstricke als auf ein biologisches Phänomen zurückzuführen. Da Neutrophile ein bemerkenswert kurzlebiger75 und äußerst fragiler Zelltyp sind, der besonders empfindlich auf Gewebedissoziation und -sortierung reagiert, ist ein schneller und dennoch schonender Arbeitsablauf von der Gewebedissoziation bis zur Zelllyse unerlässlich, um diese Zellen zu erhalten. Darüber hinaus exprimieren Neutrophile eine außergewöhnlich geringe Menge an mRNA-Molekülen76, was ihre Wiederherstellung in scRNASeq-Daten behindert. Wir haben kürzlich gezeigt, dass Neutrophile in Datensätzen, die mit der tröpfchenbasierten 10x-Chromium-Sequenzierungsplattform generiert wurden, nicht angemessen und mit anderen Plattformen nur in sehr begrenztem Umfang nachgewiesen werden können. Die in dieser Studie verwendete mikrowellbasierte scRNASeq-Plattform ermöglicht jedoch die Erfassung einer relativ großen Anzahl von mRNA-Molekülen pro Zelle und verbessert so die Gewinnung von Zellen mit niedrigem mRNA-Gehalt26. Während scRNASeq von acht Lebern einen riesigen Datensatz generierte, bleiben die Gesamtzahl und das Spektrum der Unterschiede in der Leberqualität eine Einschränkung. Obwohl wir ECD-Lebern in diese Studie einbezogen haben, können sich die Organe hinsichtlich der Transplantatqualität und bereits bestehenden Krankheiten/Schäden unterscheiden, was es unmöglich macht, bei diesem Versuch die gesamte Bandbreite interindividueller Variationen zu erfassen.

Es wurde gezeigt, dass durch Neutrophile gesteuerte Entzündungskreisläufe, wie sie in unseren NMP-Perfusaten beobachtet werden, verschiedene akute und chronische Lebererkrankungen fördern77. Ähnlich wie Neutrophile sind Monozyten/Makrophagen wichtige Regulatoren der Gewebehomöostase und der Immunaktivierung in der Leber78. Wir liefern hier Beweise dafür, dass NMP in menschlichen Lebern eine Verschiebung von hochaktivierten Neutrophilen hin zu einem gealterten/chronisch aktivierten/erschöpften Phänotyp auslöst. Insbesondere spiegelt sich die Aktivierung von Neutrophilen durch NMP in der Induktion der IL-8/CXCR1/2-Achse wider, die zum proinflammatorischen Mikromilieu beiträgt. Dies kann auch zu einer induzierten NET-Bildung führen, was zu einer Verschlimmerung des hepatischen IRI79 führt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die CXCR1/2-Hemmung während der Neutrophilenaktivierung dazu beitragen kann, eine übermäßige Entzündungsreaktion während NMP zu begrenzen.

Die Dynamik von Monozyten/Makrophagen während NMP kann nicht eindeutig als pro- oder antiinflammatorischer Phänotyp beschrieben werden, sondern weist vielmehr auf eine Reaktions- und Gegenreaktionssequenz hin. Dies spiegelt sich auch in der Subcluster-Analyse wider, die zeigt, dass entzündungsfördernde Monozyten/Makrophagen vermindert sind, während entzündungshemmende und tolerogene („M2-ähnliche“) Subtypen, die an der Zellproliferation, Angiogenese, Wundheilung und Gewebereparatur beteiligt sind, während NMP deutlich erhöht sind. jeweils.

Das derzeitige Verständnis der Auswirkungen von NMP (und maschineller Perfusion im Allgemeinen) auf das Entzündungsprofil/Immunzellrepertoire eines Organs ist begrenzt80. In Rattenlebern wurde gezeigt, dass schadensassoziierte molekulare Muster (DAMPs) während der maschinellen Perfusion Gewebeschäden auslösen81. In einem ähnlichen Modell wurde gezeigt, dass NMP eine breite Signatur der Entzündungsgenexpression und die Aktivierung leberresidenter Immunzellen induziert. Die Behandlung mit IL-10 und dem transformierenden Wachstumsfaktor (TGF)-ß führte in diesem Modell zu einer Abschwächung der Entzündung82. In einer an menschlichen Lebern durchgeführten Studie hemmte NMP Entzündungen und förderte die Transplantatregeneration83.

In Übereinstimmung mit der von Lee et al. in sechs Lebern über 6 Stunden NMP beobachteten erhöhten Zytokinexpression fanden wir im Perfusat sowohl eine pro- als auch eine antiinflammatorische Zytokinexpression83. Die Anreicherung von Interleukinen/Chemokinen im Perfusat entspricht den transkriptomischen Veränderungen in Neutrophilen und Monozyten/Makrophagen im Leberparenchym. Ein signifikanter Anstieg von IL-6 im Perfusat von DCD-Transplantaten und entsorgten Lebern kann auf eine ausgeprägtere Entzündungsreaktion in diesen Organen hinweisen. Tatsächlich berichteten Ohman et al.84 kürzlich, dass sich die Immunantwort in Lebern geringer Qualität/schlechter Funktion von funktionierenden Transplantaten unterschied, wenn sie NMP ausgesetzt wurden, obwohl für beide Gruppen exorbitant hohe Perfusatspiegel von IL-6 berichtet wurden. Daher erfordern unsere Beobachtungen weitere Aufmerksamkeit, bevor ihre klinische Bedeutung bestimmt werden kann.

Die Mobilisierung von Leukozyten und insbesondere von Neutrophilen sowie der Übergang in das Perfusat erfolgte äußerst schnell. Dies steht im Einklang mit Daten aus Lungen und Nieren von Schweinen während der NMP. In diesen Studien war eine übermäßige Migration auch mit einer verringerten Immunogenität und geringeren akuten Abstoßungsraten verbunden13,14. Wir beschreiben hierin sehr detailliert perfusierende Immunzellen und geben Einblicke in dynamische Veränderungen für eine bis zu 24-stündige Perfusion in einer Kohorte von 26 menschlichen Lebern. Während in unserer Studie am Ende der NMP eine signifikante Anzahl von Zellen im Perfusat vorhanden war, scheint die Abnahme der meisten Zelltypen mit zunehmender Perfusionszeit auf eine Abschwächung dieses Effekts hinzuweisen. Alternativ können zirkulierende Immunzellen zurück in die Leber wandern. Detailliertere und zukünftige Trackingstudien von Immunzellen zwischen Gewebe und Perfusat werden diesen dynamischen Prozess detaillierter aufklären.

Darüber hinaus kann die Modulation dieses Prozesses, z. B. durch aktive Leukozytenmobilisierung und/oder Eliminierung von Leukozyten, die antigene/inflammatorische Belastung der Leber während NMP verringern. Ein wahlloser Entzug ist jedoch möglicherweise nicht ideal, da Teilmengen zirkulierender Immunzellen auch an der Geweberegeneration, dem Gewebeumbau, der Heilung und der Toleranzinduktion beteiligt sind80. Als Beispiel zeigen wir eine starke Induktion eines entzündungshemmenden „M2-ähnlichen“ Phänotyps in Monozyten/Makrophagen während NMP. Dies kann die Reparatur- und Umbaumechanismen des Gewebes fördern und wir schlagen daher eine gezieltere Eliminierung entzündlicher und potenziell gewebeschädigender Untergruppen von Immunzellen vor. Hier schlagen wir vor, dass das selektive Targeting proinflammatorischer Neutrophilen (z. B. durch CXCR2-Antagonisten) ein erster Schritt zur gezielten Immunmodulation während der Ex-vivo-Perfusion sein könnte. Darüber hinaus könnte auch die Filtration entzündungsfördernder Zytokine während der NMP von Vorteil sein. Erste Ergebnisse einer Perfusionsstudie an menschlichen Nieren deuteten auf einen positiven Effekt auf die mit der verzögerten Transplantatfunktion verbundenen Genexpressionssignaturen hin85.

Zusammenfassend beleuchtet unsere umfassende Analyse die Dynamik des hepatischen Immunzellrepertoires während der NMP menschlicher Lebern auf transkriptomischer und Proteinebene. Eine eingehende Kartierung von Immunzellen zeigte das Vorherrschen von Neutrophilen in menschlichen Spenderlebern. Zusammen mit einer Vielzahl anderer Immunzellpopulationen wandern diese Zellen während der Leber-NMP schnell und in großem Umfang in das Perfusat. Mit der Verlängerung der Perfusion verändert sich der Aktivierungsstatus der Immunzellen von einem proinflammatorischen zu einem erschöpften, aber auch regenerativen Phänotyp. Unsere Ergebnisse und die entsprechenden Datensätze können als Grundlage für zukünftige Interventionsstudien dienen und weitere Möglichkeiten zur Linderung von Entzündungen durch gezielte Immunmodulation während NMP und LT eröffnen.

Diese Forschung entspricht allen relevanten ethischen Vorschriften. Die Studie wurde vom Institutional Review Board (Protokoll Nr. 1175/2018) der Medizinischen Universität Innsbruck genehmigt. Die Einverständniserklärung aller Teilnehmer wurde zuvor eingeholt.

Zwischen April 2019 und Juli 2021 wurden insgesamt 34 Spenderlebern, die einer NMP unterzogen wurden, rekrutiert. Alle Organe wurden mit der Absicht einer Transplantation nach NMP angenommen. Die Lebern wurden während der Entnahme mit einer Lösung der University of Wisconsin (UW, n = 14) oder Histidin-Tryptophan-Ketoglutarat (HTK, n = 20) gespült und unter Standard-Kühllagerungsbedingungen unter Verwendung derselben Konservierungsflüssigkeit auf Eis versandt. Nach dem Transport zu unserer Einrichtung (Back-to-Base-Konzept) wurden die Lebern mit dem OrganOx-Metra-Gerät gemäß den örtlichen Protokollen perfundiert2. Bei der Ankunft in unserem Zentrum wurden die Transplantate mit 2000 ml HTK gespült, um alle verbleibenden Blutzellen zu entfernen. Anschließend wurden die Lebern chirurgisch auf NMP vorbereitet und an die Perfusionsmaschine angeschlossen. Das NMP-Perfusat bestand aus drei Einheiten gepackter roter Blutkörperchen (RBC, je 300 ml) ohne Typ-O-Leukozyten (Bestrahlung mit 30 Gy), 500 ml Gelofusin (B. Braun) und Zusatzstoffen gemäß dem Protokoll des Herstellers. Gemäß den örtlichen Standards enthält eine verpackte Einheit eines Beutels mit leeren roten Blutkörperchen maximal 1 × 106 Leukozyten. Es wurde ein standardisiertes Protokoll für NMP einschließlich eines Schemas für Perfusatanalysen angewendet, das kürzlich an unserer Einrichtung eingeführt wurde2. Dazu gehört ein multidisziplinärer Ansatz mit Organbeobachtung und -management auf der Intensivstation. Die Entscheidung, ein Organ zu transplantieren oder zu verwerfen, basierte auf der Laktatabnahme, der Aufrechterhaltung des pH-Werts und dem Glukoseverbrauch. Die Aufrechterhaltung physiologischer pH-Werte (7,3–7,45) ohne Natriumbicarbonat-Supplementierung nach 2 h NMP sowie ein schneller Abfall und die Aufrechterhaltung des Laktats auf physiologische Werte (≤ 18 mg/dl) gelten als Schlüsselfaktoren für eine gute Organfunktion. Darüber hinaus gelten außergewöhnlich hohe AST-, ALT- und Laktatdehydrogenasewerte (>10.000 U/l) sowie ein starker Anstieg dieser Parameter als Warnsignale. Bei den in die Studie einbezogenen Leberempfängern handelte es sich um Erwachsene im Alter von ≥ 18 Jahren, die für eine Erst- oder erneute Transplantation vorgesehen waren.

Von 34 Spenderlebern, die NMP unterzogen wurden, wurde eine scRNASeq-Analyse in acht zufällig ausgewählten Studienlebern durchgeführt. Daher wurden Keilleberbiopsieproben zu drei einzelnen Zeitpunkten entnommen, nämlich vor der NMP (T0), am Ende der NMP (T1) und nach der Reperfusion (T2) im Falle einer Transplantation. Serielle Perfusatproben von weiteren 26 Studienlebern wurden nach 1, 4, 6, 12 Stunden und am Ende der NMP zur Zellquantifizierung/Phänotypisierung und Zytokinbewertung mittels Durchflusszytometrie und Luminex-Analyse entnommen. Detaillierte Informationen zu Probenanzahl, Gewebe-/Perfusatsammlung, Zeitpunkten und Art der Analyse finden Sie in Abb. 1.

Leberbiopsien, die vor (T0) und am Ende (T1) der NMP sowie nach der Reperfusion (T2) (n = 8 Lebern) entnommen wurden, wurden sofort auf Eis in kleine Stücke (<1 mm) zerkleinert und anschließend 10 Minuten lang enzymatisch verdaut bei 37 °C unter Rühren unter Verwendung des BD TuDoR-Dissoziationsreagenzes (BD Biosciences). Die Einzelzellsuspension wurde durch ein 100-µM-Zellsieb filtriert und die roten Blutkörperchen wurden mit der Lyselösung BD Pharm Lyse (BD Biosciences) gemäß dem Protokoll des Herstellers entfernt. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit der BD Rhapsody scRNASeq-Plattform (BD Biosciences) unter Verwendung von Calcein-AM (Thermo Fisher Scientific) und Draq7 (BD Biosciences) gemessen.

Die frisch isolierte Einzelzellsuspension wurde sofort verarbeitet (<30 Minuten von der Gewebedissoziation bis zur Zelllyse) und Sequenzierungsbibliotheken für die vollständige Transkriptomamplifikation (WTA) wurden gemäß dem BD Rhapsody-Einzelzell-WTA-Protokoll erstellt. Wir haben die mikrowellbasierte BD Rhapsody scRNASeq-Plattform mit der Absicht ausgewählt, die Leukozytendynamik umfassend zu entfalten, da sie die Darstellung von Zellen mit niedrigem mRNA-Gehalt (z. B. Neutrophile) ermöglicht und zum Verlust großer Zellen >40 µm (Hepatozyten) führen kann. aufgrund eines Perlenausschlussphänomens. Die Qualität der erhaltenen Sequenzierungsbibliotheken wurde mit dem 4200 TapeStation-System (Agilent) und dem Qubit dsDNA HS-Assay-Kit (High Sensitivity) (Thermo Fisher Scientific) überprüft. Die Sequenzierung wurde auf der NovaSeq 6000-Systemplattform (Illumina) mit dem S1 Reagent Kit v1.5 (200 Zyklen, 68 bp Index Read 1; Illumina) bei einer berechneten Sequenzierungstiefe von 50.000 Reads/Zelle durchgeführt.

Die bioinformatische Vorverarbeitung der erhaltenen FastQ-Sequenzierungsdateien wurde über die cloudbasierte Seven Bridges Platform-Umgebung (Seven Bridges Genomics) unter Verwendung der BD Rhapsody WTA Analysis Pipeline-App durchgeführt. Die Daten wurden zur weiteren Verarbeitung mit scverse-Tools in AnnData86 geladen. Die Qualitätskontrolle wurde mit scanpy87 durchgeführt, wobei nur Zellen mit (1) zwischen 250 und 8.000 erkannten Genen, (2) zwischen 1.000 und 100.000 Transkripten und (3) <30 % mitochondrialen Transkripten zurückgehalten wurden. Die 4000 am stärksten variablen Gene (HVGs) wurden mithilfe der Funktion „highly_variable_genes“ von Scanpy mit den Optionen „flavor = „seurat_v3“ und „batch_key = „patient““ ausgewählt. Zelltranskriptome wurden mithilfe von scVI88,89 in einen stapelkorrigierten latenten Raum mit niedriger Dimension eingebettet, wobei jede Probe als separate Charge behandelt wurde. Dubletten wurden mit SOLO90 identifiziert und entfernt, wie in scvi-tools89 implementiert. Basierend auf dem scVI-Latentraum wurden ein Nachbarschaftsgraph und eine UMAP-Einbettung (Uniform Manifold Approximation and Projection)91 berechnet. Zelltypen wurden auf der Grundlage unbeaufsichtigter Clusterbildung mit dem Leiden-Algorithmus92 und bekannten Markergenen annotiert.

Wir haben DESeq293 für Pseudo-Massenproben für differenzielle Expressionstests verwendet, was nachweislich eine gute Leistung erbringt und falsche Entdeckungen richtig korrigiert94. Für jeden Zelltyp und jeden Patienten haben wir die Transkriptzahlen für jedes Gen, das in mindestens 5 % der Zellen exprimiert wird, mit Dekoppler-py95 zusammengefasst. Pseudo-Massenproben, die aus weniger als 1000 Zählungen oder 10 Zellen bestanden, wurden verworfen. Die P-Werte wurden für das Testen mehrerer Hypothesen mit unabhängiger Hypothesengewichtung (IHW) angepasst96. Markergene für Monozyten-/Makrophagen- und Neutrophilen-Subcluster wurden anhand der Fläche unter der Receiver-Operator-Characteristics-Kurve (AUROC) und log2-Fold-Change-Metriken an Pseudo-Massenproben gemäß Definition in Becht et al.91 bestimmt. Markergene wurden mit einem AUROC > 0,7 und einer log2-fachen Änderung > 1 für Neutrophile und > 2 für Monozyten/Makrophagen definiert.

Wir führten eine Transkriptionsfaktoranalyse mit DoROthEA97 unter Verwendung eines multivariaten linearen Modells durch, wie es in decoupler-py95 implementiert ist. Es wurden nur Regulons mit den höchsten Konfidenzniveaus „A“ und „B“ verwendet. Als Eingabe wurden Fold-Änderungen aus der DESeq2-Analyse verwendet. Darüber hinaus führten wir eine Gen-Set-Anreicherungsanalyse unter Verwendung eines Überrepräsentationstests (ORA, dh Fishers exakter Test) durch, wie er in Dekoppler-Py implementiert ist. DE-Vergleiche zwischen verschiedenen Zelltypen weisen aufgrund einer unterschiedlichen Anzahl von Pseudobulkproben eine unterschiedliche statistische Aussagekraft auf. Um Verzerrungen aufgrund einer unterschiedlichen Anzahl unterschiedlich exprimierter Gene pro Zelltyp zu vermeiden, haben wir für den Überrepräsentationstest die 182 am unterschiedlichsten exprimierten Gene für jeden Zelltyp verwendet, was der mittleren Anzahl von DE-Genen über alle Zelltypen hinweg entspricht Falscherkennungsrate (FDR) < 0,01 und |log2-fache Änderung | > 1.

Wir haben die von omnipathdb29 erhaltene CellChat-Datenbank29 verwendet, um Unterschiede in der Kommunikation zwischen Zellen zwischen Zeitpunkten zu untersuchen. Der ursprüngliche CellChatDB-Algorithmus dient dazu, Unterschiede zwischen Zelltypen zu finden. Für unsere Studie hingegen waren wir an Unterschieden zwischen Zeitpunkten interessiert und verwendeten Patienten als biologische Replikate. Daher haben wir für jeden interessierenden Zelltyp die Liste der signifikant unterschiedlich exprimierten Liganden in CellChatDB berücksichtigt. Für jedes dieser unterschiedlich exprimierten Signalmoleküle und für jeden Zelltyp haben wir Interaktionspartner ermittelt, die potenziell von dieser Veränderung betroffen sind, also diejenigen, die in mindestens 10 % der Zellen eines bestimmten Zelltyps exprimiert werden. Differenziell exprimierte Signalmoleküle wurden mit DESeq2 wie oben beschrieben bestimmt. Der Anteil der Zellen, die ein Signalmolekül exprimieren, wurde als Mittelwert der Anteile pro Patient berechnet, um Verzerrungen aufgrund unterschiedlicher Zellzahlen pro Patient zu vermeiden.

Leberbiopsien, die vor (T0) und am Ende (T1) der NMP entnommen wurden (n = 10 zufällig aus 26 Lebern ausgewählt), wurden in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in Paraffin eingebettet. Die Multiplex-IF-Färbung wurde an 4-µm-Schnitten unter Verwendung des Opal 7-Color Automated Immunohistochemistry Kit (Kat.: NEL821001KT, Akoya Biosciences) durchgeführt. Es wurde ein Panel von Immunmarkern zusammengestellt, darunter Antikörper gegen CD15, CD8, CD68, CD3, CD20, Zytokeratin (Panel 1) und CD15, CXCR2 (Panel 2). Die Marker wurden nacheinander aufgetragen und mit den jeweiligen Opal-Fluorophoren gepaart (die verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt). Die Färbung wurde mit einem automatisierten System (BOND-RX; Leica Biosystems) durchgeführt. Um Zellkerne sichtbar zu machen, wurde das Gewebe mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (Spektral-DAPI, Akoya Biosciences) gefärbt. Die Objektträger wurden mit der Mantra 2 Quantitative Pathology Workstation (Akoya Biosciences) und der Mantra Snap-Software v1.0.4 gescannt. Für die Analyse wurden von jedem Gewebe fünf bis acht repräsentative Bilder aufgenommen. Spektrale Entmischung, multispektrale Bildanalyse und Zellphänotypisierung wurden mit der inForm Tissue Analysis Software v2.4.10 (Akoya Biosciences) durchgeführt. Die Immunzelldichte wurde quantifiziert und wird als „Anzahl Zellen/mm2“ angegeben. Der gepaarte T-Test wurde verwendet, um die Unterschiede zwischen den beiden Gruppen zu bewerten. Bei der gruppierten Analyse werden Datenpunkte in Streudiagrammen mit Mittelwerten ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dargestellt. Die Analysen wurden mit GraphPad Prism v6.0 durchgeführt.

Aus Leberbiopsien vor NMP (T0) und am Ende von NMP (T1) isolierte Zellen wurden mit einem Cocktail aus 19 Antikörpern (Ergänzungstabelle 8) in vortitrierten Konzentrationen gefärbt und nach Waschen und Zugabe von 7-AAD gemessen auf einem FACSymphony A5 Durchflusszytometer. Die Daten wurden mit der Software FlowJo v10.7 analysiert (Einzelheiten zur Gating-Strategie finden Sie in der ergänzenden Abbildung 12).

Serielle Perfusatproben von 26 Lebern, die NMP (5 ml) ausgesetzt waren, wurden nach 1, 4, 6, 12 Stunden und am Ende der NMP in Cyto-Check BCT-Röhrchen (Streck) gesammelt. Durch die sofortige Zellfixierung in diesen Röhrchen bleiben die Zellmorphologie und die Oberflächenantigenexpression erhalten und die Lagerung der Proben bei Raumtemperatur für mindestens 5 Tage möglich. In unserer Studie wurden Fixierungsrohre ausgewählt, um die Logistik zu vereinfachen. Für jede Färbung wurden 500 µl Perfusat verwendet. Zunächst wurden rote Blutkörperchen von 500 µl Perfusat mit dem RBC Lysis Buffer (Thermo Scientific, eBioscience) lysiert. Nach der Blockierung mit Fc-Blockierungsreagenzien (BD Bioscience) wurden die Zellen mit den Antikörper-Mastermischungen in verschiedenen Kombinationen inkubiert, die die in der Ergänzungstabelle 9 genannten Antikörper enthielten. Für die intrazelluläre FoxP3-Färbung wurden die Zellen unter Verwendung des Foxp3/Transkriptionsfaktor-Färbepuffersatzes permeabilisiert ( Thermo Scientific, ebioscience) und vor der Inkubation mit dem FoxP3-Antikörper mit normalem Rattenserum (Thermo Scientific, ebioscience) inkubiert. Zur Quantifizierung der absoluten Zellzahlen wurden BD Trucount Tubes (BD Bioscience) gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet und mit einem LSRFortessa-Durchflusszytometer (Becton Dickinson and Company) analysiert. Der Dublett-Ausschluss wurde durch Auftragen von Vorwärts- und Seitwärtsstreuflächen, -höhen und -breiten (FSC- und SSC-A/-H/-W) erreicht. Die Daten wurden mit FlowJo v6.2 (Tree Star) analysiert. Die Gating-Strategie ist in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 13–20. Zur Prüfung der Zelllebensfähigkeit wurde das Perfusat zu Beginn der NMP, nach 1 Stunde und am Ende der NMP (n = 5) gesammelt. Rote Blutkörperchen wurden mit RBC-Lysepuffer lysiert und Leukozyten mit Trypanblau gefärbt. Es wurden mindestens 150 Zellen/Probe doppelt gezählt, die Ergebnisse gemittelt und der Prozentsatz toter/lebender Zellen berechnet.

Serielle Perfusatproben von 26 NMP-behandelten Lebern wurden zentrifugiert und 500 µl Serum bei –80 °C eingefroren. Die Zytokin-/Chemokin-Proteinspiegel wurden mit dem Cytokine&Chemokine 34-Plex Human ProcartaPlex Panel 1A (EPX340-12167-901, Thermo Fisher Scientific) in einem Luminex MAGPIX-Instrument (Luminex Corporation) gemessen und mit der Software xPonent 4.2 Rev.2 (Luminex Corporation) analysiert. gemäß dem Protokoll des Herstellers. Das Zytokinprofil wurde im Lichte des Spendertyps (DBD-Lebern vs. DCD-Lebern) und des Transplantationsstatus (transplantierte vs. verworfene Lebern) beurteilt.

Perfusatdaten werden als absolute Werte oder Anteile (%), geschätzte Durchschnittswerte ± Standardabweichung (SD) und 95 %-Konfidenzintervall (KI) ausgedrückt. Für die Dynamik der Zellzusammensetzung wurde ein linear-mixed-effect-Modell für wiederholte Messungen (LMM) verwendet. Aufgrund der positiv verzerrten Verteilung wurde eine logarithmische Transformation durchgeführt. Eine einfache ANOVA wurde verwendet, um Unterschiede unter Berücksichtigung der gesamten Perfusion im Zeitverlauf zu bewerten. Die Analyse der differenziellen Genexpression einzelner Zellen wurde mit DESeq2 an Pseudo-Massenproben durchgeführt, die durch biologische Replikate aggregiert wurden. Die Analysen wurden mit der Statistiksoftware R (v4.0.3, Team RC, R Foundation for Statistical Computing)98 durchgeführt. Die Grafiken wurden mit GraphPad Prism 9.1.0 (216) erstellt. P-Werte für ungezielte Analysen (DE-Gene, TFs, Gensätze) wurden FDR-angepasst. Signifikanzniveaus und weitere Details zu den statistischen Tests sind in den Bildunterschriften angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Sequenzdaten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen (alle Abbildungen), sind über den NCBI GEO-Zugang GSE216584 verfügbar. Alle weiteren Daten sind im Artikel und seinen Zusatzdateien oder auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der Quellcode zur Reproduktion der Datenanalyse ist unter https://github.com/icbi-lab/nmp-liver verfügbar. Verarbeitete Eingabedaten und containerisierte Softwareabhängigkeiten, die zur Ausführung des Codes erforderlich sind, sind bei zenodo verfügbar: https://doi.org/10.5281/zenodo.7249006.

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Referenzen herunterladen

Die Autoren danken Astrid Drasche und Annabella Pittl für die technische Unterstützung und DI Wolfgang Peter für die statistische Unterstützung. Die Forschung wurde gefördert durch den Österreichischen Wissenschaftsfonds FWF (Grant No. TAI-697) (DW), die „In Memoriam Gabriel Salzner Stiftung“ (SS, DW), den Tiroler Wissenschaftsfond (TH), den Jubiläumsfonds – Österreichische Nationalbank (RO), FFG-Stipendium Österreichische Forschungsförderungsgesellschaft, 858057 (HD FACS, S.So.). GS wurde durch ein DOC-Stipendium der Österreichischen Akademie der Wissenschaften unterstützt. Die Autorin Margot Fodor (MF) wird einen Teil der Materialien und Daten dieser Studie für die Fertigstellung ihrer Doktorarbeit verwenden. These.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: T. Hautz, S. Salcher, M. Fodor.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: D. Wolf, S. Schneeberger.

Abteilung für Viszeral-, Transplantations- und Thoraxchirurgie, Zentrum für Operative Medizin, organLife-Labor und D. Swarovski-Forschungslabor, Medizinische Universität Innsbruck, Innsbruck, Österreich

, T. Hautz , M. Fodor , S. Ebner , B. Cardini , J. Hofmann , T. Resch , F. Krendl , A. Weissenbacher , G. Otarashvili , D. Öfner , J. Troppmair , R. Oberhuber & S . Schneeberger

Abteilung für Innere Medizin V, Hämatologie und Onkologie, Comprehensive Cancer Center Innsbruck (CCCI), Medizinische Universität Innsbruck, Innsbruck, Österreich

S. Salcher, A. Mair, M. Trebo, G. Untergasser, S. Sopper, A. Martowicz, S. Daum, M. Kalb, A. Pircher & D. Wolf

Institut für Bioinformatik, Biozentrum, Medizinische Universität Innsbruck, Innsbruck, Österreich

G. Sturm & Z. Trajanoski

Tyrolpath Obrist Brunhuber GmbH, Zams, Austria

G. Untergasser, A. Martowicz & P. ​​​​Obrist

Institut für Pathologie, Neuropathologie und Molekulare Pathologie, Medizinische Universität Innsbruck, Innsbruck, Österreich

B. Zelger

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Konzeptualisierung und Studiendesign (TH, RO, AP, DW, S.Sc.), Datenerfassung (MF, BC, JH, TR, FK, AW, GO, RO, AP), durchgeführte sc-RNA-Sequenzierung und analysierte Daten ( S.Sa., GS, GU, A.Mai., MT, S.So., MK), führte eine Durchflusszytometrieanalyse durch und analysierte Daten (SE, MF, TH, S.So.), führte Luminex durch und analysierte Daten ( MF, TH), Pathologie und mikroskopische Analysen (A.Mar., PO, BZ), Visualisierung (S.Sa., MF, GU, A.Mar., SD, D.Ö., ZT, JT), Original verfasst Entwurf (TH, S.Sa., MF), Überprüfung und Endbearbeitung des Artikels (alle). OR, PA, WD und SS trugen gleichermaßen als leitende Autoren bei.

Korrespondenz mit D. Wolf oder S. Schneeberger.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Damien Chaussabel und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Hautz, T., Salcher, S., Fodor, M. et al. Entfaltung der Immunzelldynamik durch Einzelzell-RNA-Sequenzierung in der normothermen maschinellen Perfusion der Leber. Nat Commun 14, 2285 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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Eingegangen: 22. Februar 2022

Angenommen: 27. März 2023

Veröffentlicht: 21. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37674-8

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